Laboratoř aplikované mikrobiologie
Mikrobiologie životního prostředí
Mikrobiologie životního prostředí je rozsáhlý obor, který se zabývá studiem vlastností mikroorganismů vyskytujících se v životním prostředí a podílejících se na dějích ovlivňujících základní procesy života v přírodě, koloběh prvků (C, O, N, S), diversitu, metabolismus vyšších organismů, ale také např. i mikroorganismů schopných degradovat polutanty, které kontaminují prostředí a ohrožují lidské zdraví. V naší laboratoři zkoumáme vlastnosti mikroorganismů (především bakterií), které jsou schopné degradovat organické polutanty, jejich aerobní a anaerobní metabolismus, enzymové vybavení, strukturu a toxicitu vznikajících produktů na prokaryotní i eukaryotní organismy a jejich případnou genotoxicitu. Vedle vlastností samotných mikroorganismů jsou studovány interakce a vazby s dalšími organismy (rostlinami), které ovlivňují funkční a taxonomickou diversitu aktivních mikrobiálních populací a jejich degradační aktivitu. Součástí řešení této problematiky jsou následující témata:
- isolace a identifikace aerobních i anaerobních mikroorganismů v půdě kontaminované polychlorovanými a polybromovanými sloučeninami (PCB, TCE, PCE), polyaromatickými uhlovodíky, pesticidy (HCH, HCB, DDT), určení jejich degradačních schopností, biochemická a genetická charakterizace
- metagenomické studium mikrobiální diversity a jejích změn v kontaminovaném prostředí v závislosti na biotických a abiotických podmínkách prostředí
- studium interakcí mikroorganismů a rostlin v kontaminované půdě - rhizoremediace
- studium metabolismu a degradační aktivity xenobiotik v rostlinách
- isolace a studium vlastností rostlinných enzymů zodpovědných za degradaci, identifikace produktů metabolismu
- testování toxicity a genotoxicity kontaminantů životního prostředí a produktů jejich mikrobiálního a rostlinného metabolismu
Součástí problematiky, která souvisí se studiem metabolismu xenobiotik je i příprava dokonalejších organismů schopných degradovat další resistentní xenobiotika vnášením genů zodpovědných za akumulaci či degradaci xenobiotik do rostlinných buněk. Součástí práce je:
- příprava transgenních rostlin s biodegradačními geny mikroorganismů
- příprava transgenních rostlin schopných vyšší akumulace těžkých kovů
- testování resistence transgenních rostlin vůči xenobiotikům
- studium degradačních schopností transgenů
Transientní (dočasná) exprese 
Transgenní rostlina obsahující markerový gen exprimující ve fúzi
s požadovaným genem i gen pro glukuronidasu jehož přítomnost se projevuje modrým zabarvením
Výše zmíněná tematika je řešena na Ústavu biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha ve spolupráci se Společnou laboratoří ÚOCHB AV ČR a VŠCHT.
V rámci řešených výzkumných projektů spolupracují naše laboratoře s dalšími specialisovanými pracovišti např. na Universitě Karlově (Ústav biochemie), Mendelovou zemědělskou a lesnickou universitou v Brně , Mikrobiologickým ústavem AV ČR a Ústavem experimentální botaniky AV ČR.
Studium, příprava, izolace a charakterizace antimikrobiálních peptidů
- příprava peptidů s antimikrobiálním účinkem - izolace z přírodních zdrojů (např. hmyzu, rostlin a rostlinných tkáňových kultur), jejich purifikace a charakterizace biochemickými technikami (SDS-PAGE, MS MALDI-TOF, sekvenční analýza atp.), testování antimikrobiálních účinků izolovaných látek na vybraných mikroorganismech
- příprava terapeuticky význammých rekombinantních peptidů a krátkých proteinů pomocí mikrobiálních expresních systémů, optimalizace, izolace a purifikace rekombinantních peptidů a proteinů
Význam peptidových a proteinových léčiv (tzv. bioléčiv, biofarmak nebo biofarmaceutik) neustále roste a stává se nezastupitelnou součástí farmaceutického průmyslu. Mezi biofarmaceutika patří peptidy (např. insulin), proteiny (např. srážecí faktor VIII, interferon beta atd.) včetně protilátek (např. protilátka proti receptoru CD-20). Výzkum a aplikace bioléčiv se zaměřuje na léčbu rakoviny (např. rakovina lymfatického systému - tzv. non-Hodgkin lymfomu, rakovina prsu, rakovina tlustého střeva, leukémie), autoimunitních onemocnění (např. roztroušená skleróza, revmatoidní arthritida, Crohnova nemoc, psoriáza), cukrovky, anémie, a na náhradu chybějícího proteinu (např. lidského růstového hormonu) a další.
Některé peptidy a proteiny vykazují i antimikrobiální účinky a tak mohou být využity jako náhrada antibiotik, na které si cílové patogenní kmeny vytvořily rezistenci (jedno antibiotikum) či multirezistenci (více antibiotik). Infekce způsobeny takovými patogeny jsou často fatální. Kmeny Mycobacterium tuberculosis rezistentní k rifampicinu a isoniazidu, společně s virem HIV způsobují onemocnění, jež jsou na prvních místech v počtu úmrtí na infekční onemocnění. V důsledku onemocnění tuberkulózou pak v roce 2007 zemřelo 1,77 milionu obyvatel, což v rozvojových zemích představuje 98 % všech úmrtí. Ve světle těchto alarmujících údajů Světové zdravotnická organizace již počátkem devadesátých let minulého století označila tyto a další infekční patogeny vykazující rezistenci za globální zdravotnický problém a zahájila přípravu rámcového programu, jenž měl nejen zajistit dostatek účinných léků, ale též jejich správné podávání.
Jako možná náhrada antibiotik, která díky resistenci kmenů ztratila účinnost, se nabízejí antimikrobiální peptidy a proteiny. Tyto látky mají sice rozdílnou strukturu, ale některé jejich vlastnosti jsou společné, např. malá velikost, amfipatická struktura a kladný náboj, což jim umožňuje selektivní působení a inkorporaci do buněčné membrány patogenů nebo např. nádorových buněk. Hledané peptidy jsou součástí vrozené imunitní odpovědi všech živých organismů napříč evolucí. V databázích najdeme již několik set antimikrobiálních peptidů, většina z nich byla izolována z hmyzu (např. magainin) a z rostlin (defensiny, cyklotidy, knotiny), ale také člověka a jiných savců (především defensiny). Antimikrobiální peptidy a proteiny vykazují inhibiční účinek proti bakteriím, kvasinkám, plísním, ale navíc i proti virům, nádorovým buňkám a protozoím.
Hlavním cílem naší laboratoře je izolace peptidů a proteinů s antimikrobiálními účinky z hmyzu a rostlin s využitím rozličných biochemických technik. Jejich charakterizace z hlediska antimikrobiálního účinku (stanovení minimální inhibiční koncentrace (= MIC) a objasnění jejich mechanismu účinku (pomocí fluorescenční mikroskopie) a jejich struktury (MALDI-TOF MS, sekvenční analýza).
Příprava peptidů a proteinů přírodního původu, s prokazatelně terapeutickými účinky, může být realizována také chemickou syntézou nebo může být využita rekombinantní technologie. Syntetické a rekombinantní peptidy a proteiny mohou být navíc modifikovány tak, aby dosáhly optimálních farmakologických vlastností, a naopak měly sníženou toxicitu a jiné nežádoucí účinky, což může značně přispět k jejich úspěchu v klinických testech. Proto jsme zvolili další možný přístup, a to přípravu vybraných terapeutických rekombinantních peptidů a krátkých proteinů v mikrobiálních expresních systémech (především v bakteriích Escherichia coli) – tzn. přípravu mikrobiálních expresních systémů pomocí metod genového inženýrství – a dále optimalizaci purifikace rekombinantních peptidů a proteinů z mikrobiálních buněk.
Další zajímavé informace získáte v sekci řešené projekty.