Prosím počkejte chvíli...
Nepřihlášený uživatel
Nacházíte se: VŠCHT PrahaFPBTÚstav biochemie a mikrobiologie  → Vědecké zaměření ústavu → Vědecké skupiny → Laboratoř potravinářské mikrobiologie
iduzel: 29802
idvazba: 37929
šablona: stranka
čas: 26.9.2017 19:40:02
verze: 3813
uzivatel:
remoteAPIs:
branch: trunk
Obnovit | RAW

Laboratoř potravinářské mikrobiologie

Skupina zabývající se problematikou patogenů přenášených potravinami a detekcí geneticky modifikovaných organismů (GMO) se vytvořila již v polovině devadesátých let v prostorech mimo VŠCHT, v budově Ústavu mechaniky a struktury hornin ČAV, V Holešovičkách 41/94, Praha 8 (Rokoska). Naším prvním cílem bylo dokonalé profesionální zvládnutí ISO ČSN metod pro kvalitativní a kvantitativní stanovení patogenů přenášených potravinami v potravinových matricích. Zároveň byly zaváděny metody založené na identifikaci izolované DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR). Tato reakce je základem hlavní metody užívané ke stanovení transgenní DNA v různých typech GMO. V laboratoři jsme se zaměřili na nejvýznamnější transgenní rostliny v zemědělství, kukuřici a sóju. ISO metody pro GMO jsou teprve nyní kodifikovány a uváděny v platnost, proto jsme v této oblasti vypracovali standardní operační postupy (SOP). Toto úsilí vyvrcholilo v roce 2006, kdy byla laboratoř akreditovaná ČIA ke zkušební činnosti v oblasti mikrobiologie a molekulární biologie. Potraviny, používané pro výživu, jsou zřídka sterilní, většinou obsahují četná mikrobiální společenstva, jejichž složení je dáno původem potraviny a jejím zpracováním. Většina těchto mikroorganismů, pochází z přirozené mikroflory potravinářských surovin, nebo z mikroflory vnesené během zpracování, t.j. během sklizně, porážky, skladování a distribuce. Počty jednotlivých mikroorganismů ve zkoumaných potravinách vypovídají o historii jejich vzniku.

Ve většině případů mikroflora potravin nemá zjistitelný účinek a konsum potraviny nepůsobí problémy. V některých případech má přítomnost mikroorganismů nevratný účinek:

  • Způsobuje kažení potraviny a mění její organoleptické vlastnosti
  • Je původcem onemocnění konzumenta
  • Positivně mění vlastnosti potraviny, jako např. různé typy fermentací

Po období nevyjasněné legislativy, která upravovala přípustná množství jednotlivých druhů mikroorganismů v různých typech potravin, bylo průlomem vydání Nařízení komise (ES) č.2073/2005 o mikrobiologických požadavcích na potraviny, které bylo po dvou letech novelizováno Nařízením komise (ES) č. 1441/2007 a dále Nařízením komise (EU) č. 365/2010. Základním motem těchto nařízení je, že potraviny nesmějí obsahovat mikroorganizmy nebo jejich toxiny či metabolity v množstvích, která představují nepřijatelné riziko pro lidské zdraví.

Od samého počátku založení naší laboratoře jsme se zabývali problematikou stanovení Listeria monocytogenes, Staphyloccoccus aureus, Campylobacter jejuni/coli, Cronobacter sakazakii a Salmonella sp. Pro tyto mikrorganismy jsme zavedli platné ISO ČSN postupy a rovněž jsme zavedli protokoly založené na izolaci DNA s následnou PCR, kde hlavní roli hraje výběr vhodných primerů. Při studiu vlastností izolátů shora uvedených kmenů, jsme jako jednu z charakteristik zavedli zjišťování rezistence k antibiotikům.Využíváme standardní postupy ke stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), ale také genetické postupy ke zjištění charakteru lokusů DNA odpovědných za rezistenci. Dále jsme se začali zabývat problematikou tvorby biofilmů, které představují odlišnou formu existence mikroorganismů vyznačující se zvýšenou odolností k antibiotikům, desinfekčním prostředkům a dalším vlivům prostředí. Studium exprese genů kodujících enterotoxiny S. aureus bylo zahájeno před 2 lety a pozornost je věnována možnosti rychlé detekce jejich produkce.

Co se týká GMO, hlavní úsilí bylo věnováno výběru vhodné metody izolace DNA, které byly testovány na kukuřici, sóje a bramborách. Přítomnost GMO byla prokazovaná pomocí monitorovacích sekvencí určujících transgenní DNA (promotory a terminátory transkripce, selekční markery). K průkazu byla využívaná PCR a dále pak PCR s flurescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR). Původní SOP postupy jsou v současnosti nahrazovány ISO ČSN protokoly.

Řešené projekty

Kvalitativní a kvantitativní detekce potravinových patogenů

Základním dokumentem potravinářské mikrobiologie je Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. listopadu 2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny a jeho další změny (Nařízení komise (ES) č. 1441/2007, Nařízení komise (EU) č. 365/2010), která vymezují kritéria bezpečnosti potravin, kritéria hygieny výrobního procesu a pravidla pro odběr vzorků a přípravu zkušebních vzorků.

Detekce a izolace potravinových patogenů probíhá v souladu s platnými ISO a EN/ISO normami (ISO-International Organization for Standardization, EN-European norm) založenými na kultivačních metodách stanovení. V případě kvalitativního průkazu patogenu (nepřítomnost ve 25 g či 10 g potraviny) je provedeno nejdříve jeho selektivní pomnožení v potravině ve vhodných tekutých médiích a následná izolace za využití selektivních a diagnostických tuhých půd. Při kvantitativních analýzách je tato izolace provedena přímo. Závěrečná identifikace poté zjišťuje fenotypové projevy biochemických vlastností specifických pro jednotlivé patogeny. Kultivační metody sice umožňují izolaci živého mikroorganismu, rychlost samotné detekce se však vzhledem k časové náročnosti zkoušky pohybuje v řádu několika dní. Proto jsou vyvíjeny a validovány rychlé molekulárně-genetické metody, umožňující detekci patogena na bez nutnosti jeho izolace, pouze na základě přítomnosti jeho DNA (případně mRNA) ve vzorku. Identifikace je poté provedena na základě zjištění přítomnosti rodově či druhově specifických genů, využitých k návrhu primerů pro polymerázovou řetězovou reakci. Detekce těchto PCR produktů může být poté provedena elektroforeticky, analýzou jejich křivky tání či za využití DNA čipů. Samostatným problémem je poté metodika izolace DNA z různých potravinových matrix (v případě kvalitativní analýzy vyžadující taktéž pomnožení) spolu s detekčním limitem těchto metod a modifikací izolačních technik za účelem izolovat DNA pouze životaschopných mikroorganismů.

Staphylococcus aureus na agaru Baird-Parker. (originál)Staphylococcus aureus na agaru Baird-Parker.

Druhově specifická PCR detekce Campylobacter jejuni a Campylobacter coli. (originál)Druhově specifická PCR detekce Campylobacter jejuni a Campylobacter coli.

 Identifikace Enterobacteriaceae pomocí Enterotestu. (originál)Identifikace Enterobacteriaceae pomocí Enterotestu.

Rezistence k antibiotikům u potravinových patogenů

Hlavním zdrojem vzniku rezistence k antibiotikům u potravinových patogenů je jejich používání ve veterinární praxi. Subletální koncentrace antibiotika mohou vést k selekci mutantů s mutací cílové struktury nebo k urychlení šíření genetických determinant rezistence horizontálním přenosem mobilními genetickými elementy v mikrobiální populaci. Výskyt rezistence k antibiotikům spolu s odpovídajícím genetickými determinanty studujeme nejvíce u potravinových a klinických izolátů termotolerantních Campylobacter spp., převážně Campylobacter jejuni a Campylobacter coli, původců kampylobakterióz, nejčastějšího gastrointestinálního onemocnění současnosti, a u klinických a environmentálních izolátů rodu Salmonella, původce salmonelózy, druhého nejčastějšího gastrointestinálního onemocnění, kde se jedná zvláště o rezistenci k tetracyklinu.

 Stanovení MIC tetracyklinu pomocí E-testu (Campylobacter jejuni). (originál)Stanovení MIC tetracyklinu pomocí E-testu (Campylobacter jejuni).

Vyšetření antibiotické rezistence diskovou difuzní metodou. (originál) Vyšetření antibiotické rezistence diskovou difuzní metodou.

Tvorba biofilmu a jeho odolnost k desinfekčním látkám

Bakterie se v přirozeném prostředí převážně vyskytují nikoliv ve formě volně pohyblivých planktonických buněk, ale jako přisedlá společenství na pevném podkladu - biofilm. Buňky biofilmu jsou s povrchem a navzájem mezi sebou ireversibilně spojeny extracelulárními polymerními látkami (EPS - extracellular polymeric substance), které tvoří až 85 % celkové hmoty biofilmu a jsou složené převážně z polysacharidů. Biofilm je protkán kanálky, které slouží k rozvodu živin a umožňují buněčnou komunikaci prostřednictvím nízkomolekulárních látek. Buňky biofilmu mají díky EPS vyšší odolnost před vlivy vnějšího prostředí (nutriční stresy, průnik antimikrobiálních látek), vykazují též odlišný růst a genovou expresi oproti buňkám planktonickým. Vazby jsou tak pevné, že buňky nemohou být z povrchu odstraněny pouhým oplachem a tímto se biofilm stává nežádoucí v mnoha oblastech lidského života. Z klinického hlediska se například jedná o zubní plak či biofilm pokrývající lékařské implantáty a katetry. Z hlediska potravinářské mikrobiologie je velkým problémem biofilm ve výrobních a přepravních zařízeních, kde způsobuje korozi materiálů či kontaminaci produktů. Z tohoto důvodu se zabýváme studiem podmínek tvorby biofilmu u jednotlivých potravinových patogenů (vliv média, teploty, stresové podmínky, působení antimikrobiálních látek) spolu se studiem struktury a exprese genů regulujících jeho tvorbu. Pro účely praxe poté studujeme působení desinfekčních a antimikrobiálních látek na devitalizaci a tvorbu biofilmu.

Znázornění tvorby biofilmu - nejprve dochází k adhezi buněk a tvorbě mikrokolonií, což je doprovázeno produkci EPS. Následuje tvorba a zrání biofilmu a nakonec odpoutání buněk z biofilmu. (originál)Znázornění tvorby biofilmu - nejprve dochází k adhezi buněk a tvorbě mikrokolonií, což je doprovázeno produkci EPS. Následuje tvorba a zrání biofilmu a nakonec odpoutání buněk z biofilmu.

Tvorba biofilmu u Listeria monocytogenes v mikrotitračních destičkách detekovaná obarvením biofilmu krystalovou violetí. (originál)Tvorba biofilmu u Listeria monocytogenes v mikrotitračních destičkách detekovaná obarvením biofilmu krystalovou violetí.

Genotypizační metody

Genotypizační metody jsou užívány ke zjištění míry příbuznosti mezi jednotlivými izoláty daného druhu získanými z různých zdrojů v různém čase. Genotypizační metody mohou být založeny na štěpení DNA restrikčními endonukleázami s následnou amplifikací získaných fragmentů pomocí PCR (AFLP-Amplified Fragment Length Polymorphism), na amplifikaci úseků ohraničených repetitivními sekvencemi (REP-PCR, ERIC-PCR) či na amplifikaci fragmentů náhodnými primery (RAPD). Metoda PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) využívá makrorestrikční analýzu genomové DNA provedenou in situ. Množina získaných fragmentů je poté analyzována z hlediska jejich přítomnosti či nepřítomnosti u jednotlivých izolátů, kdy míra shody je mírou jejich příbuznosti. Srovnání sekvencí vybraných konzervativních genů využívá metoda MLST (Multi-Locus Sequence Typing).

 Ukázka genotypizace salmonel metodou ERIC-PCR. (originál)Ukázka genotypizace salmonel metodou ERIC-PCR.

 Dendrogram sestrojený pro izoláty Salmonella na základě ERIC-PCR genotypizace. (originál)Dendrogram sestrojený pro izoláty Salmonella na základě ERIC-PCR genotypizace.

 Dendrogram izolátů Listeria monocytogenes (AFLP- EcoRI a MseI, fluorescenčně značené primery, vyhodnocení na kapilárním přístroji pro sekvenace ABI 310). (originál)Dendrogram izolátů Listeria monocytogenes (AFLP- EcoRI a MseI, fluorescenčně značené primery, vyhodnocení na kapilárním přístroji pro sekvenace ABI 310).

Studie exprese genů kódující stafylokokové enterotoxiny

Staphylococcus aureus je významný patogen produkující celou řadu toxických látek vyvolávající různá onemocnění. Z pohledu potravinářské mikrobiologie je jeho nejvýznamnější vlastností schopnost produkce termostabilních enterotoxinů, jenž mohou způsobit alimentární intoxikace neboli otravy z jídla.

Hlavním cílem tohoto projektu je právě studium exprese genů, které se na tvorbě enterotoxinů podílí, a to jak na úrovni mRNA, tak i na úrovni proteinu. Na úrovni mRNA je využívána metoda reverzní transkripce kvantitativní real-time PCR (RT-qPCR), na úrovni proteinu imunochemická metoda ELISA. Vedle této činnosti je u testovaných kmenů S. aureus prováděna i základní fenotypová a genotypová charakterizace. K tomuto účelu jsou využívány moderní mikrobiologické či molekulárně-biologické metody (spektrofotometrické techniky, elektroforetické techniky, různé varianty metody PCR aj.).

 Příklad real-time PCR analýzy. (originál)Příklad real-time PCR analýzy.

Podpora

  • 6th RTD Framework BIOTRACER (contract 036272) - Improved biotraceability of unintended microorganisms and their substances in food and feed chains
  • 2B08050 Listeria monocytogenes - Postupy umožňující spolehlivé hodnocení kvality a bezpečnosti mléčných výrobků, etap technologického procesu výroby, finálních výrobků a jejich skladování
  • 2B08074 - Metody hodnocení úrovně hygieny a účinnosti sanitace výrobních zařízení a prostředí mlékáren, postupy detekce a eliminace perzistentních kmenů jako nástroje kontroly zpracování mléka na kvalitní a bezpečné potraviny
  • NAZV QI101B267 - Vývoj a aplikace nových efektivních postupů pro kontrolu kvality produktů zemědělské v řetězci prvovýroba a posouzení bezpečnosti potravin
  • GAČR P503/10/0664 - Isolace, typisace a vývoj imunochemických a instrumentálních metod pro detekci a charakterisaci bakterií Cronobacter sp.
  • LD11048 - Genetická podstata ATB resistence bakterií Salmonella spp. isolovaných z Pražských čistíren odpadních vod
  • MEB111004 - Produkce bakteriocinů bakteriemi mléčného kvašení a jejich využití jako konzervačních činidel
  • TA01010485 - Vývoj prototypu a ověření bezpečnosti a funčnosti dámských hygienických prostředků s probiotickým účinkem pro prevenci urogenitálních infekcí
  • MZE QJ1210300 - Protection systems of quality and safety of dairy products by means of suitable methods applicable in practice
  • MZE QJ1210300 - Systémy jištění kvality a bezpečnosti mlékárenských výrobků vhodnými metodami aplikovatelnými v praxi

 

Spolupráce

  • Státní zdravotní ústav Praha, Centrum hygieny potravinových řetězců v Brně
  • University of Copenhagen, Department of Veterinary Disease Biology, Denmark
  • Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i. Praha 6 Ruzyně
  • Výzkumný ústav potravinářský v.v.i. Praha
  • MILCOM a.s. Praha 6
  • Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.
  • Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha
  • CERELA-CONICET (Centro de Referencia para Lactobacilos), Tucumán, Argentina
  • Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT Praha
  • ARKO-CONSULT, s.r.o.

Lidé a kontakty

prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc.

doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.

doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.

Ing. Jana Kadavá

Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.

Ing. Hana Sýkorová, Ph.D.

Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D.

Ing. Hana Stiborová, Ph.D.

Ing. Hana Turoňová, Ph.D.

Gabriela Radová

Šárka Katolická

Iva Razáková, DiS.

Ing. Diliara Akhatova

Ing. Martina Boháčová

Ing. Viviana Fuchsová

Ing. Martina Kračmarová

Mgr. Ekaterina Shagieva

Ing. Martin Tereň

Ing. Lucie Vondráková

Aktualizováno: 9.6.2017 16:23, Autor: Vojtěch Spiwok

VŠCHT Praha
Technická 5
166 28 Praha 6 – Dejvice
IČO: 60461373
DIČ: CZ60461373

Datová schránka: sp4j9ch

Copyright VŠCHT Praha 2014
Za informace odpovídá Oddělení komunikace, technický správce Výpočetní centrum

zobrazit plnou verzi