Naše skupina se dlouhou řadu let věnuje vypracovávání a aplikacím metod využívajících bioafinitní interakce molekul k jejich identifikaci, kvantifikaci popř. separaci.
VÝVOJ DETEKČNÍCH SYSTÉMŮ
V první řadě se zabýváme vývojem detekčních systémů pro stanovení nízkomolekulárních i vysokomolekulárních látek. Jedná se o jednoanalytové nebo multianalytové imunochemické metody ELISA (z angl. Enzyme Linked Immunosorbent Assay), popř. LFIA (z angl. Lateral Flow Immunoassay). U těchto metod se využívá existence nekovalentních (nevazebných) interakcí. Jedná se především o interakce typu antigen-protilátka, biopolymer-pevný povrch, avidin-biotin aj. V posledních letech se soustředíme především na aplikaci imunochemických technik pro detekci a stanovení kontaminantů životního prostředí (např. pesticidů), analytů z klinické biochemie (např. anabolika, drogy), isoflavonoidů, mikroorganismů (Listeria monocytogenes, rod Cronobacter), jejich produktů (enterotoxiny Staphylococcus aureus).
Aktuálně řešené projekty
Detekce anabolických androgenních steroidů (AAS) ve vzorcích potravin
- vývoj rychlých a jednoduchých metod, jež by umožnily spolehlivě odhalit AAS v doplňcích stravy
Detekce nových psychoaktivních drog (NPS, z angl. New Psychoactive Substances)
- vývoj imunochemických metod pro detekci syntetických kanabinoidů nebo tryptaminů v biologických tekutinách
NPS jsou syntetizovány jako strukturní analoga nebo chemické deriváty již zákonem kontrolovaných látek. Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně.
STUDIUM BAKTERIÍ RODU CRONOBACTER
Další neméně zajímavou oblastí našeho zájmu jsou bakterie rodu Cronobacter, oportunní patogeny vyvolávající život ohrožující infekce převážně u novorozenců a jedinců s oslabenou imunitou. Tyto mikroorganismy studujeme od jejich základních vlastností až po interakce s hostitelským organismem. Používané metody zahrnují celou řadu přístupů; např. izolaci a přečistění buněčných frakcí a proteinů, PCR, RFLP, MLST, hmotnostní spektrometrii, práci s databázemi a tkáňovými kulturami.
Aktuální řešené projekty
Zkoumání bakterií rodu Cronobacter
- detailní charakterizace a přesná identifikace
Bakterie rodu Cronobacter jsou velmi rozmanité ve svých vlastnostech a schopnostech. Tato pestrost způsobila překotný vývoj jejich taxonomie a pro nás představuje stále nové výzvy v jejich přesné identifikaci a klasifikaci. Používáme zejména metody molekulární biologie PCR a MLST a hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF/TOF.
- mezidruhová variabilita
- interakce rodu Cronobacter s buněčnými liniemi
V literatuře již byly popsány některé faktory virulence, nicméně proces patogeneze stále není zcela objasněn. Zejména exprese proteinů v hostitelském prostředí není téměř vůbec zmapovaná. Identifikace kmenů schopných adheze a invaze do lidských buněčných linií a sledování těchto interakcí by bylo prvním krokem k následnému studiu virulentních proteinů, které jsou patogenem exprimovány přímo v hostiteli.
- identifikace faktorů virulence u patogenních zástupců rodu Cronobacter
Cílem této části práce je nalézt proteiny, které jsou unikátní pro patogenní druhy. Je velmi pravděpodobné, že se jedná o faktory virulence a jejich identifikace by přispěla k pochopení a popisu patogeneze. Dále by tyto proteiny mohly být použity pro vývoj imunochemických metod. Tyto metody vynikají svojí rychlostí a nízkou cenou a byly by dobrým nástrojem pro detekci patogenních druhů Cronobacter.
Proteiny jsou izolovány z různých buněčných frakcí, charakterizovány prostřednictvím SDS-PAGE a identifikovány pomocí LC-ESI-Q-TOF MS. Při hledání vhodných proteinů pro imunochemickou detekci je využívána imunomagetická separace.
Vybrané publikace
Novotný J., Svobodová B., Šantrůček J., Fukal L., Karamonová L.: Membrane proteins and proteomics of Cronobacter sakazakii cells: Reliable method for identification and subcellular localization. Appl Environ Microbiol 88 (9), e02508-21, pp 1-17, 2022; IF 5,005; Q2; OA
Holubová B., Kubešová P., Huml L., Vlach M., Lapčík O., Jurášek M., Fukal L.: Tailor-made immunochromatographic test for the detection of multiple 17 alpha-methylated anabolics in dietary supplements. Foods 10 (4), 741, 2021; IF 4,350, Q1, OA
Huml, L.; Havlova, D.; Longin, O.; Stankova, E., Holubova, B., Kuchar, M.; Prokudina, E.; Rottnerova, Z.; Zimmermann, T.; Drasar, P.; Lapcik, O.; Jurasek, M., Stanazolol derived ELISA as a sensitive forensic tool for the detection of multiple 17α-methylated anabolics. Steroids 2020, 155, 108550. IF 2.317, Q4
Arnoštová, J.; Arnoštová, L.; Holubova, B., Vysoká přesnost analýzy v klinické biochemii – nutnost, či nikoliv? Přehled ilustrující problematiku na příkladu stanovení kortizolu v biologických vzorcích. Chem Listy 2020, 114 (5), 349-354. IF 0.326, Q4
Šuláková, A., Fojtíková, L., Holubová, B., Bártová, K., Lapčík, O., Kuchař, M. Two immunoassays for the detection of 2C-B and related hallucinogenic phenethylamines.: J. Pharmacol.Toxicol 2019, 95, 36-46.
Holubová, B., Mikšátková, P., Kuchař, M., Karamonová, L., Lapčík, O., Fukal, L. (2019): Immunochemical techniques for anabolic androgenic steroid – matrix effects study for food supplements. Eur. Food Res. Technol. 2019, 245, 1011-1019.
Karamonová L., Holubová B., Jelínková A., Novotný J., Svobodová B. Stafylokokové enterotoxiny – superantigeny schopné ošálit imunitní systém. Chem Listy 2019, 113(11), 668-674.
Fojtíková L., Holubová B., Kuchař M., Lapčík O., Maryška M., Šuláková A. Tryptamine derivates having short linking bridge bearing carboxy functional group, and chemical processes for preparing the compounds useful for preparing immunogens by conjugation with the carrier protein. CZ Patentový spis 307719-B6, 2019.
Vlach J, Javůrková B, Karamonová L, Blažková M, Fukal L: Novel PCR-RFLP system based on rpoB gene for differentiation of Cronobacter species. Food Microbiol 2017, 62, 1-8.
Svobodová B, Vlach J, Junková P, Karamonová L, Blažková M, Fukal L: Novel method for the reliable identification of Siccibacter and Franconibacter strains: From ‘pseudo-Cronobacter’ to new Enterobacteriaceae genera. Appl Environ Microbiol 2017, 83(13), e00234-17.
Fojtíková L, Fukal L, Blažková M, Sýkorová S, Kuchař M, Mikšátková P, Lapčík O, Holubová B: Development of enzyme-linked immunosorbent assay for determination of boldenone in dietary supplements. Food Anal Methods 2016, 9(11), 3179-3186.
Svobodová B, Vlach J, Junková P, Karamonová L, Blažková M, Fukal L: Novel method for the reliable identification of Siccibacter and Franconibacter strains: From ‘pseudo-Cronobacter’ to new Enterobacteriaceae genera. Appl Environ Microbiol 2017, 83(13), e00234-17.
Jurášek M, Göselová S, Mikšátková P, Holubová B, Vyšatová E, Kuchař M, Fukal L, Lapčík O, Drašar P: Highly sensitive avidin-biotin ELISA for detection of nandrolone and testosterone in dietary supplements. Drug Test Analysis 2017, 9(4) 553-560.
: Diversity of O-antigens within the genus Cronobacter: from disorder to order. Appl Environ Microbiol 2015, 81, 5574-5582.
: The potential of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the identification of biogroups of Cronobacter sakazakii. Rapid Commun Mass Spectrom 2013, 27(3), 409-418.
: Rapid Immunoassays for Detection of Anabolic Nortestosterone in Dietary Supplements. Czech J Food Sci 2013, 31(5), 514–519.
: Immunochromatographic strip test for detection of genus Cronobacter. Biosens Bioelectron 2011, 26(6): 2828-2834. ISSN 0956-5663.
Lidé a kontakty
vedoucí skupiny:
prof. Ing. Ladislav Fukal, CSc.
odborní asistenti:
doc.Ing. Barbora Holubová, Ph.D.
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
doc. Ing. Martina Krausová, Ph.D.
technický personál: