Home Projekty Publikace Vybavení Členové Aktuality
TESTY MODULACE MDR
Testy modulace MDR identifikují látky zvyšující citlivost nádorových buněk na léčbu. Tyto testy zkoumají různé mechanismy rezistence, jako jsou efluxní pumpy, apoptotické dráhy a metabolismus buněk. Typické přístupy zahrnují kombinační testy s chemoterapeutiky, inhibitory efluxních pump, modulátory apoptózy a metabolismu. Testy modulace MDR jsou klíčovým nástrojem pro identifikaci nových léčivých kombinací a personalizovanou medicínu v boji proti nádorové rezistenci.
Přístrojové vybavení: Automatizovaná pipetovací stanice Biomek FX Laboratory Workstation (Beckman Coulter Life Sciences, USA)
AKUMULAČNÍ TESTY
Přístrojové vybavení: Automatická počítačka buněk Cellometer Luna-II (Logos biosystems, Jižní Korea)
WESTERN BLOT
Western blot je laboratorní technika používaná k detekci specifických proteinů ve vzorku. Proteiny jsou nejprve děleny podle velikosti pomocí gelové elektroforézy, poté přeneseny na membránu. Na membránu se aplikují specifické protilátky, které se vážou na cílový protein, a následně se detekují pomocí enzymu spojeného se sekundární protilátkou. Výsledný signál se vizualizuje, což umožňuje identifikaci a kvantifikaci cílového proteinu.
ELISA
ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) je analytická metoda využívaná ke kvantitativnímu stanovení různých antigenů. Principem metody je vysoce specifická interakce antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný. Stanovuje se pak spektrofotometricky.
Přístrojové vybavení: promývačka HydroSpeed (Tecan, Švýcarsko), čtečka mikrotitračních destiček Infinite F Nano+ (Tecan, Švýcarsko)
CYTOTOXICITA
Pro sledování toxicity jsou využívány buněčné linie odvozené od lidských tkání, nejčastěji se jedná o dermální fibroblasty či keratinocyty pro látky určené pro dermální aplikace a ledvinové buňky pro perorální aplikace.
Protinádorová aktivita je následně sledována jako poměr cytotoxicity vůči kontrolní buněčné linii a vůči nádorové buněčné linii. Díky bohaté národní i mezinárodní spolupráci disponuje laboratoř bohatou sbírkou nádorových buněčných linií rezistentních k chemoterapeutikům, proto je možné sledovat i kolaterální senzitivitu, tedy zvýšenou cytotoxicitu látek vůči lékově-rezistentní v porovnání s lékově-senzitivní buněčné linii.
Cytotoxicita je obvykle sledována pomocí standardní resazurinové metody založené na metabolické aktivitě buněk, kdy živé buňky metabolizují resazurin na fluorescenční produkt.
Přístrojové vybavení: multimodální čtečka mikrotitračních destiček SpectraMax i3x MiniMax (Molecular Devices, USA), dávkovač kapalin a buněk Dispenzor (BioTech, USA)
LUCIFERÁZOVÉ REPORTÉROVÉ TESTY
Luciferázové reportérové testy jsou laboratorní techniky používané k měření genové exprese a studiu promotorových aktivit. Využívají enzym luciferázu, který po přidání substrátu katalyzuje reakci vedoucí k emisi světla. Světelný signál je kvantifikován luminometrem, což poskytuje informace o aktivitě konkrétního promotoru nebo genové exprese. Tyto testy se používají ke studiu promotorových aktivit, signalizačních drah a zkoumání genové regulace. V naší laboratoři se věnujeme promotorům spojených s transkripčními faktory NFκB, Nrf2 a p53.
Přístrojové vybavení: inkubátory s řízenou teplotou a atmosférou s CO2 (Memmert, Německo; ThermoFisher Scientific, USA), laminární boxy (BioAir, Španělsko)
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda používaná k amplifikaci specifických úseků DNA. Proces zahrnuje tři kroky: denaturaci DNA, nasednutí primerů a elongaci cíleného úseku, tyto kroky se v několika cyklech opakují. Tato metoda umožňuje rychle a přesně vytvářet velké množství kopií DNA i z malého počátečního vzorku. Využívá se při klonování, identifikaci, produkci proteinů a dalších molekul. Druhá generace této metody – kvantitativní PCR s templátem komplementární DNA k původní RNA (RT-qPCR) umožňuje kvantifikovat transkripci různých bakteriálních i nádorových genů, zejména pak efluxních pump.
Přístrojové vybavení: termocyklér CFX96 (Bio-Rad, USA), pipetovací stanice OT-2 (Opentrons, USA)
AGARÓZOVÁ ELEKTROFORÉZA
Agarózová elektroforéza je metoda používaná k separaci biomolekul (DNA, RNA), podle jejich velikosti a náboje. Vzorky napipetované do jamek v agarózovém gelu jsou poháněny elektrickým polem skrz gel směrem k pozitivně nabité elektrodě. Menší molekuly procházejí póry v gelu rychleji než větší molekuly, což vede k jejich separaci podle velikosti. Pomocí specifických barviv následně dochází k vizualizaci vzorků v gelu (elektroforeogram), z něhož lze určit např. velikost biomolekuly. Využívá se pro kontrolu PCR a určení velikosti biomolekul.
MIKRODILUČNÍ METODA
Mikrodiluční metoda (ISO 20776-1) je kvantitativní laboratorní metoda vyjadřující citlivost mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. V mikrotitračních destičkách se připraví řada ředění testované látky, do nichž se přidá standardizované množství mikroorganismů. Po inkubaci se hodnotí nárůst mikroorganismů v jednotlivých jamkách. Tato metoda je vhodná pro určení minimální inhibiční koncentrace (MIC), pro stanovení účinnosti antibiotik a dalších antimikrobiálních látek.
Přístrojové vybavení: Elektronické pipety (Eppendorf, ČR)
TRANSFORMACE BUNĚK ESCHERICHIA COLI PLASMIDEM NESOUCÍ GEN REZISTENCE K ANTIBIOTIKŮM
Pomocí PCR a Gibsson Assembly je připraven plasmid nesoucí gen rezistence (nejčastěji gen pro destruktasy) in vitro. Takto připravený plasmid je pomocí tepelného šoku transformován do buněk E. coli. Takto připravená kultura je následně využita pro hledání inhibitorů mechanismu rezistence a potenciálních adjuvans.
Přístrojové vybavení: Thermomixer (LAB MARK a. s., ČR), T-Personal Thermocycler (BioTech, USA)
IZOLACE A PURIFIKACE REKOMBINANTNÍHO PROTEINU
Transformované buňky E. coli jsou dezintegrovány a supernatant získaný po odstředění je přečištěn pomocí afinitní chromatografie (nejčastěji na bázi Ni-NTA). Afinitní chromatografie na bázi Ni-NTA využívá specifickou vazbu histidinem značených proteinů (His-tagged proteins) k nikelnatým iontům imobilizovaných na agarose. Proteinový extrakt se aplikuje na kolonu, kde jsou proteiny s histidinovou kotvou imobilizovány, zatímco nečistoty prochází kolonou. Eluce takto značených proteinů se provádí pomocí imidazolu, který kompetuje s histidinovými rezidui o vazbu na nikelnaté ionty. Výsledkem je čistá izolace cílených proteinů z komplexní směsi. Proteiny (destruktasy) jsou dále využívány k měření enzymatické aktivity a hledání vhodných inhibitorů.
PŘÍPRAVA MODELŮ TĚLNÍCH BARIÉR IN VITRO
Modely tělních bariér in vitro jsou připravovány za účelem testování přestupu různých látek, od potravinových doplňků až po potenciální léčiva. Současně jsou pokročilejším modelem pro studium fyziologických procesů jako je například rezistence na léčiva nebo zánětlivé procesy. Zaměřujeme se zejména na modely hematoencefalické bariéry, střevní bariéry a dále na oční rohovku. Tyto modely jsou připravovány kultivací více buněčných typů najednou na transwellových insertech v různém uspořádání tak, aby výsledný systém co nejvíce napodoboval situaci in vivo. Buňky jsou na insertech kultivovány do vytvoření vrstev s těsnými spojeními, což se projeví vzrůstem elektrického odporu.
Přístrojové vybavení: Millicell ERS-2 Epithelial Volt-Ohm Meter (Merck Millipore, USA)